SuperTOPO-Amp平末端克隆试剂盒

产品及特点 本产品是基于 Topoisomerase 能够在几秒钟之内高速连接 DNA 片段的原理开发的无背景克隆试剂盒，它使用了本公司通过定点突变改良的 TOPO酶，连接效率比野生型更高。本试剂盒具有下列特点：

1. 高效快速，连接反应几乎在几秒钟内完成，连接率几乎达到 100。

2. 适用于 pfu、KOD 等高保真聚合酶扩增的平末端片段的克隆。

3. 无杂带或引物二聚体的PCR 扩增产物可以不经过纯化直接用于连接反应。

4. 零背景，无需 IPTG-X-Gal 蓝白斑筛选，故不需要 IPTG-X-Gal 培养基。

5. 本试剂盒按 10 uL 标准反应体系，有 25 次和 50 次两种规格包装供选择。

6. 提供含 Amp 和 Kan 两种抗性的载体供选择（160684-25A/50A 是含Amp 抗性 TOPO 载体，160684-25K/50K 是含 Kan 抗性 TOPO 载体）。
规格及成分 成 份 编 号 25 次热封袋包装 50 次热封袋包装
SuperTOPO-Amp
Blunt 载体
YB-358R-A 25 uL（其一） 50 uL（其一）
SuperTOPO-Kan
Blunt 载体
YB-358R-K 25 uL（其一） 50 uL（其一）
连接缓冲液 LM160684B 25 uL 50 uL
M13F 引物 50 uL 50 uL
M13R 引物 50 uL 50 uL
超纯水 100935 1 mL 1 mL
使用手册 1 份
注意：LM160684-25A/50A 提供 SuperTOPO-Amp Blunt 载体， LM160684-25K/50K 提供 SuperTOPO-Kan Blunt 载体。 

运输及保存 低温运输，-20℃保存，有效期一年。

自备试剂 DNA 插入片段、感受态细胞、SOB 或 LB 培养基（含抗菌素和不含的） 

使用方法 1. 如果是 PCR 制备插入片段，所用引物不能磷酸化，使用 pfu、KOD 等产

生平末端片段的高保真 DNA 聚合酶。为保证扩增产物的完整性，PCR 循

环结束后，再延伸 5-10 分钟，确保片段延伸完全。

2. 电泳检测并相对定量 PCR 片段（跟 DNA marker 比较）。根据插入片段长度和下表确定每次连接反应需要的佳用量：

插入片段长度 佳用量

100-1000 bp 20-50 ng

1000-2000 bp 50-100 ng

2000-5000 bp 100-200 ng

3. 在一个干净的塑料离心管中，室温下（不要放在冰上）设置如下连接反应

体系：

成 份 用 量

纯化后的 PCR 产物 不超过 8 uL（详见注意事项）

SuperTOPO-Amp Blunt 载体或

SuperTOPO-Kan Blunt 载体

1 uL

连接缓冲液 1 uL

超纯水 补到 10uL

注意：如果使用未经纯化的 PCR 产物，则需要加入量不能超过 1 uL，否

则 PCR 体系会干扰连接体系。

4. 轻柔吹打混匀后，短暂离心，常温（20-30℃）放置 0-5 分钟。如果在冬天室温低于 20℃，建议使用 25℃水浴或金属浴。注意：连接时间超过 5分钟的话连接效率会降低。

5. 如果当天不转化，可以将离心管放-20℃保存。如果转化，则取 5 uL 连接液加到 50-100 uL 刚刚融化的感受态细胞中，轻柔混匀。注意：本产品要求感受态细胞的转化效率不得低于 5 x 10E7cfu/ug。

6. 如果片段长度小于 2 Kb，则不需要冰浴和热激，直接在离心管中加入 500uL 不含抗菌素的 SOC 或 LB 培养基，然后取 200 uL 涂盘。也可以先3000g 离心 2 分钟后，弃掉大部分上清，只留约 100 uL 左右，然后重悬细菌后全部涂盘在含 Amp（对 SuperTOPO-Amp）或 Kan（对SuperTOPO-Kan）的培养皿上，37℃过夜培养。

7. 如果片段长度长于 2 Kb，则按常规转化方式，先冰浴 2-30 分钟，然后42℃热激 30 秒，冰上防放置 2 分钟，再在离心管中加入 500 uL 不含抗菌素的 SOC 或 LB 培养基，37℃ 250 rpm 培养 60 分钟，然后取 200uL 涂盘。也可以先 3000g 离心 2 分钟后，弃掉大部分上清，只留约 100uL 左右，然后重悬细菌后全部涂盘在含 Amp（对 SuperTOPO-AmpBlunt 载体）或 Kan（对 SuperTOPO-Kan Blunt 载体）的培养皿上，37℃过夜培养。

8. 用 M13F/M13R 通用引物进行菌落 PCR 或直接测序来鉴定重组子。