酵母Y1HGold化学感受态细胞

产品及特点 Y1HGold菌株是Clontech公司开发的GAL4-AbA酵母单杂系统用菌株，MATα型，可直接转化质粒进行筛库试验。Transformation marker为：ura3，leu2；报告基因为：AbAr。Y1HGold-GAL4-AbA 酵母单杂系统需要两种质粒配套使用：pAbAi 和PGADT7。

质粒pAbAi的筛选标志为URA，用于表达 pBait-AbAi construct（1-3个bait DNA序列重复串联后克隆到pAbAi中）；质粒pGADT7的筛选标志为LEU，用于表达AD（GAL4 C端768-881位氨基酸）与目标蛋白（Prey）的融合蛋白。GAL4-AbA酵母单杂系统原理：Aureobasidin A（AbA）是一种环酯肽抗生素，在低浓度（0.1-0.2 µg/mL）下即可对酵母产生毒性。基因组中整合了pBait-AbAi的酵母菌株（Bait-Reporter Yeast Strains），当猎物蛋白（Prey）结合到诱饵序列（Bait DNA）上，GAL4 AD就会激活AbAr的表达，从而能够在含有抗生素AbA的培养基上生长。AbAr与营养缺陷报告基因相比具有更低背景的优点，可以降低酵母单杂假阳性发生的概率。Y1HGold感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pGADT7质粒检测转化效率>104 cfu/μg DNA。Y1Hgold的基因型是：MATα, ura3-52, his3-200, ade2-101, trp1-901, leu2-3, 112, gal4Δ, gal80Δ, met-, MEL1。 规格及成分 成分 编号 包装

Y1HGold 感受态细胞 140392A 0.1 mL×10

PGADT7，10 ng/μL 140392B 10µL

Carrier DNA，10 μg/μL 140392C 100µL

PEG/LiAc 140392D 5 mL

使用手册 140392sc 1 份

运输及保存 感受态细胞干冰运输、-80℃保存，Carrier DNA -20℃保存；PEG/LiAc 4℃保存；有效期半年。 自备试剂 目的 DNA、YPDA、 SD 培养基等

使用方法 1. 取 pBait-AbAi 质粒 5µg，BstBI 或 BbsI 酶切 1 小时，回收。

2. 取 100µL 冰上融化的 Y1HGold 感受态细胞，依次加入预冷的线性 pBait-AbAi 质粒1-5 µg（体积不高于 15 µL），Carrier DNA（95-100℃ 5 min，快速冰浴，重复一次）10µl，PEG/LiAc 500µL 并吸打几次混匀，30℃水浴 30 min（15 min 时翻转 6-8 次混匀）。

3. 将管放 42℃水浴 15 min（7.5 min 时翻转 6-8 次混匀）。

4. 5000 rpm 离心 40 s 弃上清，ddH2O 400µL 重悬，离心 30s 弃上清。

5. ddH2O 50µL 重悬，涂 SD/-Ura 平板，29℃培养 72 h。

6. 挑取 5-10 个克隆，用 PCR 方法确定 pBait-AbAi 整合到 Y1HGold 基因组中，PCR阳 性 菌 株 在 SD/-Ura 平 板 划 线 ， 29 ℃ 培 养 72 h ， 4 ℃ 保 存 ， 此 菌 株 即 是Y1HGold[Bait/AbAi] 菌株。 注意事项 1. 感受态细胞最好在冰上融化。

2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

3. 同时转化 2-3 种质粒时可增加质粒的用量。

4. Y1HGold 酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为 27-30℃；高于 31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。

5. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的 Adenine 被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成 Adenine 以供利用，然而，有些菌株的 ADE2 基因被破坏，Adenine 合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8 基因均正常，所以造成中间产物 P-ribosylamino imidazole（AIR）在细胞中积累而使菌落变为粉红色。

6. 酵母在缺陷培养基中生长速度比 YPDA 培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂 YPDA 平板 29℃，48 h 培养可见直径 1 mm 克隆；涂 SD 单缺平板 29℃，48-60 h 培养可见直径 1 mm 克隆，涂 SD 双缺平板 29℃，60-80 h 培养可见直径 1 mm 克隆，涂 SD 三缺或四缺平板平板 29℃，80-90 h 培养可见直径 1mm 克隆。