Alexa Fluor®488 NHS Ester (Succinimidyl Ester) Alexa Fluor 488-N-羟基琥珀酰亚胺酯

产品信息

产品描述

      Alexa Fluor^® 488 是一种亮绿色荧光染料，具有水溶性和较强的pH稳定性（pH4-10），可被488nm激发产生信号稳定的荧光，常作为一种细胞标记物偶联到抗体、多肽、蛋白、示踪剂和其他底物上广泛用于细胞成像和检测。 

Alexa Fluor® 488 NHS Ester，即含N-羟基琥珀酰亚胺（N-Hydroxysuccinimide）活化基团的Alexa Fluor 488，可直接与生化分子上的氨基（-NH2）反应形成稳定的酰胺键，主要是伯胺，可用于标记任何含伯胺的蛋白、多肽、氨基修饰的寡核苷酸或者其他含氨基的生物分子。

产品性质

运输和保存方法

冰袋运输。-20℃干燥避光保存，有效期至少3个月。

注意事项

1）NHS ester基团对湿度非常敏感，务必干燥保存产品。使用前产品需放到室温回温至少20min。
2）NHS ester基团的水解发生在水溶性缓冲体系属于竞争性反应。对蛋白/多肽伯胺的连接反应建议在pH 7-9范围内进行。

3）不要使用任何含伯胺的缓冲液，比如Tris，甘氨酸、铵盐、或其他稳定蛋白如BSA等。

4）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

标记方法（以IgG为例）

注意：该染料可标记任何蛋白，此方案是以IgG为例进行优化的，可根据需要按照该方案调整合适的体系。

1. 用1mL不含氨基的合适的缓冲液（eg.100mM碳酸氢钠缓冲液）充分溶解约10mg蛋白。
注：
① 标记的效果具有浓度依赖性，当浓度低于2mg/ml，会严重影响标记效率，标记蛋白浓度需控制在2-20mg/mL
② 标记体系应避免任何含氨基的底物，如Tris、glycine、铵盐、或其他稳定蛋白如BSA等，如待标记的蛋白溶液中含有上述物质的污染，则需透析到10-20mM的磷酸盐缓冲液（PBS）中，再向每毫升蛋白溶液中加入0.1mL 1M碳酸氢盐缓冲液(pH 8.3–9.0)调至所需pH值。
③ 抗体溶液中存在的微量叠氮钠（＜3mM）或硫汞撒（＜1mM）不会干扰标记反应。

2. 使用前用高质量无水DMSO溶解Alexa Fluor 488-NHS至10mg/mL。
注：Alexa Fluor 488-NHS虽然具有水溶性，但是在水溶液中，会被水解成非活性游离酸。因此一旦溶解，该染料活性就可能减弱，尤其是在水溶液中，本品就会变得很不稳定。

3. 向蛋白样品中缓慢加入50-100µLAlexa Fluor488-NHS试剂，充分混匀。
注：加入Alexa Fluor488-NHS试剂的量在0.5-1mg。不同的蛋白和标记试剂的标记效果不同，请根据具体情况优化染料与蛋白的比例。

4. 边搅拌边于室温孵育60min（或更长）；

5. 利用合适介质去除未反应的试剂；

6. 测定Alexa Fluor® 488-蛋白标记效率（DOL）和标记浓度。

① 测定A280和A494：利用1cm路径的比色皿检测标记物在280nm和494nm的吸光值，此处可根据需要对样品进行稀释。

② 计算样品中蛋白的浓度：

ε280 is molar extinction coefficient protein(M-1cm-1)at 280nm. ε280 of Alexa Fluor 488 is 71,000.

CF is a correction factor to account for absorption of the dye at 280 nm.CF= A280 free dye/Amax free dye .  CF280(Alexa Fluor® 488)=0.11.

③ 计算DOL值：

ε494 is the approximate molar extinction coefficient of the Alexa Fluor® 488 dye at 494 nm.