TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（Alexa Fluor 488）

产品信息

产品描述

细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。 

TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling) 细胞凋亡检测试剂盒（Alexa Fluor 488）可以用来检测组织细胞在凋亡晚期过程中细胞核DNA的断裂情况。其原理是在末端脱氧核糖核苷酸转移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）的作用下，在基因组DNA断裂时暴露出的3´-羟基（3´-OH）末端掺入Alexa Fluor 488-12-dUTP，从而可以用荧光显微镜或流式细胞仪检测。

Alexa Fluor 488染料稳定性更高，信号更强，从而使标记物更亮，抗淬灭能力更强。

本试剂盒应用范围广，可用于检测冷冻或石蜡切片中的细胞凋亡情况，也可检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。

产品组分

运输与保存方法

冰袋（wet ice）运输。

本试剂盒储存在-20℃，Alexa Fluor 488-12-dUTP Labeling Mix避光储存于-20℃，保质期为1年。

注意事项

1）需自备用于洗涤细胞的PBS，用于封片的抗荧光淬灭封片液，用于固定的4%多聚甲醛。

2）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

操作步骤

一、样品准备

A. 石蜡包埋组织切片

1）室温下将石蜡组织切片放入二甲苯中浸泡5 min，重复一次，以彻底脱掉石蜡。

2）室温下用100%乙醇浸泡切片5 min，重复一次。

3）室温下用梯度乙醇（90、80、70%）各浸洗1次，每次3 min。
4）用PBS轻轻润洗切片，并用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余液体。此时可用石蜡笔或疏水笔在样品周围描绘样品分布的轮廓，便于下游透性处理和平衡标记操作。在实验过程中切勿让样品干燥，处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润。

5）按1:100的比例，用PBS作为稀释液来稀释2 mg/ml的Proteinase K溶液，使其终浓度为20 μg/ml。
6）每个样本滴加100 μl浓度为20 μg/ml的Proteinase K溶液，使其被全部覆盖，室温孵育20 min。【注】：Proteinase K帮助组织和细胞对后续步骤的染色试剂通透。孵育时间过长会增加组织切片在后续洗涤步骤中从载波片上脱落的风险，过短则可能造成透性处理不充分，影响标记效率。为得到更好的结果，可能需要优化Proteinase K孵育的时间。
7）PBS溶液润洗样本2-3次，轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理后的样本放在湿盒中保持样本湿润。

B. 组织冰冻切片

1）取出冰冻切片，并回温至室温。将玻片浸没在4%多聚甲醛溶液（溶于PBS）中固定，室温下孵育30 min。

2）轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余的液体。

3）将玻片浸没在PBS溶液中，室温孵育15 min，重复PBS洗一次，共2次。
4）轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余液体。此时可用石蜡笔或疏水笔在样品周围描绘样品分布的轮廓，便于下游透性处理和平衡标记操作。在实验过程中，切勿让样品干燥，处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润。

5）按1:100的比例，用PBS作为稀释液来稀释2 mg/mL的Proteinase K溶液，使其终浓度为20 μg/mL。
6）每个样本上滴加100 μL浓度为20 μg/mL的Proteinase K溶液，使其被全部覆盖，室温孵育10 min。【注】：Proteinase K帮助组织和细胞对后续步骤的染色试剂通透。孵育时间过长会增加组织切片在后续洗涤步骤中从载波片上脱落的风险，过短则可能造成透性处理不充分，影响标记效率。未得到更好的结果，可能需要优化Proteinase K孵育的时间。

7）在盛有PBS溶液的敞口烧杯中润洗样本2-3次。

【注】：为了避免在清洗步骤中的样本脱片损失，建议不用洗瓶清洗，而是将玻片浸在PBS溶液中2-3次进行清洗。

8）轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理后的样本放在湿盒中保存样本的湿润。

C. 细胞爬片的准备

在Lab-Tek载波片小室（Chamber Slides）上培养贴壁细胞。在凋亡诱导处理之后，用PBS洗2遍载玻片。

D. 细胞涂片的制备（以多聚赖氨酸包被的载玻片为例）


1）以约2×107个细胞/mL的浓度将细胞重悬于PBS中，吸取50-100 μL细胞悬液滴于多聚赖氨酸包被的载玻片上，用一片干净的载玻片轻柔的涂开细胞悬液。

2）固定细胞，将载玻片浸入装有4%新鲜配制于PBS中的多聚甲醛的染色缸中，在4℃放置25 min。

3）洗涤载玻片，将其浸入PBS中，室温放置5 min。重复用PBS洗一次。
4）轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余液体。这时可用石蜡笔或疏水笔在样品周围描绘样品分布的轮廓，便于下游透性处理和平衡标记操作。在实验过程中，切勿让样品干燥，处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润。

5）按1:100的比例，用PBS作为稀释液来稀释2 mg/mL的Proteinase K溶液，使其终浓度为20 μg/mL。
6）每个样本上滴加100 μL浓度为20μg/mL的Proteinase K溶液，使其被全部覆盖，室温孵育5 min（也可浸于0.2%配制于PBS中的Triton X-100溶液中，室温孵育5 min进行通透处理）。【注】：Proteinase K帮助组织和细胞对后续步骤的染色试剂通透。孵育时间过长会增加组织切片在后续洗涤步骤中从载波片上脱落的风险，过短则可能造成透性处理不充分，影响标记效率。未得到更好的结果，可能需要优化Proteinase K孵育的时间。

7）PBS润洗样本2-3次，轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理后的样本放在湿盒中。

二、DNA酶处理阳性对照的步骤

在样本通透处理后，用DNA酶I处理细胞来准备阳性对照载玻片。该流程通常会引起被处理的大多数细胞显现绿色荧光。

【注】：DNA酶I处理固定的细胞会引起染色体DNA的断裂，产生许多可标记的DNA 3’-末端。
1） 按1:10的比例用去离子水稀释10×DNase I Buffer(每个样本需用200 µL 1×DNase I Buffer，即需要用20 µL 10×DNase I Buffer和180 µL去离子水混合稀释)，取其中100 µL滴加到已通透的样本上，室温孵育5 min。 向剩余100 μL 1×DNase I Buffer中加1μL DNase I (1U/μL)，使其终浓度为10 U/mL。

2）轻轻叩掉液体，加入100μL含10 U/mL DNase I 的缓冲液，室温孵育10 min。

3）轻叩载玻片，去掉多余的液体，并将载玻片在装有去离子水的染色缸中彻底洗3-4次。

【注】：阳性对照载玻片必须使用单独的染色缸，否则阳性对照载玻片上残余的DNase I 可能会在实验载玻片上引入高背景。

三、标记与检测

1）按1:5的比例用去离子水稀释适量5×Equilibration Buffer（每个样品需要100 μL 1×Equilibration Buffer）。
2）每个样本滴加100 μL 1×Equilibration Buffer使其全部覆盖待检样本区域，室温孵育10-30 min。或者将载玻片放入一个含有1×Equilibration Buffer的缸中，保证缓冲液没过样本。在平衡细胞的同时在冰上解冻Alexa Fluor 488-12-dUTP Labeling Mix，并依照表1，准备足够量的用于所有实验的和可选阳性对照反应的TdT孵育缓冲液。对于面积小于5 cm2的一个标准反应，其体积是50 μL，用50 μL乘以实验和阳性对照反应的数目来确定所需TdT孵育缓冲液的总体积。对于表面积更大的样本，可成比例的增大试剂体积。

表1准备用于实验的和可选阳性对照反应的TdT孵育缓冲液

【阴性对照体系】：准备一份不含TdT酶的对照孵育缓冲液，用ddH2O替代TdT酶。
3）在平衡后的区域周围用吸水纸洗掉100μL 1×Equilibration Buffer中的大部分，然后在5 cm2面积的细胞上加入50 μL TdT孵育缓冲液。不要让细胞干掉。这之后的操作，载玻片要避光。

  4）把塑料盖玻片盖在细胞上以保证试剂的平均分布，在湿盒的底部放上用水浸湿的纸巾。将载玻片置于湿盒内，在37℃孵育60 min。将湿盒用铝箔纸包裹以避光。

 【注】：塑料盖玻片在使用前可以切成两半。折起盖玻片的边缘以便于移除和操作。

       5）移除塑料盖玻片，并将切片置于PBS溶液中室温孵育5 min，换用新鲜PBS再重复清洗2次。

     6）用滤纸轻轻擦掉样本周围及背面的PBS溶液。

【注】：为了降低背景，载玻片在用PBS洗一遍后，可再用含0.1% Triton X-100和5 mg/mL BSA的PBS洗3次，每次5 min，这样游离的未反应的标记物可以清楚较干净。

7） 样本在染色缸中染色，在黑暗中将载玻片浸入装有PI溶液（1 μg/mL，用PBS新鲜配制并稀释）的染色缸，室温放置5 min。（可选）：样本在染色缸中染色，在黑暗中将载玻片浸入装有DAPI溶液（2 μg/mL，用PBS新鲜配制并稀释）的染色缸，室温放置5 min。

      8）洗涤样本，将载玻片浸入去离子水中，室温放置5分钟。重复两次，总共洗三次。

     9）叩干载玻片上多余的水并向样本区域加100 μL PBS保持样本湿润。
    10）立即在荧光显微镜下分析样本，用标准的荧光过滤装置在520±20 nm的荧光下观察绿色荧光；在＞620 nm下观察PI的红色荧光，或在460 nm观察蓝色的DAPI。如有必要，载玻  片能在4℃黑暗条件下存放过夜。【注】：PI/DAPI能将凋亡和未凋亡的细胞都染成红色/蓝色，只在凋亡的细胞核中才有Alexa Fluor 488-12-dUTP掺入而定位的绿色荧光。

四、利用流式细胞术检测悬浮细胞

1）将3-5×106个细胞用PBS在4℃离心（300×g）洗两次，4℃ 300 g离心10 min，然后重悬在0.5mL PBS中。

2）固定细胞，加入5 mL 1%配制于PBS中的多聚甲醛溶液，冰上放置20min。

3）细胞在4℃300×g离心10 min，去上清并且重悬于5 mL PBS。重复洗一次，并用0.5 mL PBS重悬细胞。
4）通透细胞，加入5 mL冰上预冷的70%乙醇，在-20℃孵育4小时。细胞能在70%乙醇中-20℃条件下保存一周，或者细胞可用配制于PBS中的0.2% Triton X-100溶液通透，室温放置5 min。

5）细胞在300×g离心10 min，并用5 mL PBS重悬。重复离心，并1 mL PBS重悬。

6）转移2×106个细胞至一个1.5 mL的微量离心管。

7）300×g离心10 min，去上清，并用80μL 1×Equilibration Buffer重悬。室温孵育5 min。
8）在平衡细胞的同时，在冰上融解Alexa Fluor 488-12-dUTP Labeling Mix，并依照表1，准备足够量用于所有反应的TdT孵育缓冲液。对于2×106个细胞的一个标准反应，其体积是50μL，50μL乘上反应数目即所需TdT孵育缓冲液的总体积。
9）细胞在300×g离心10 min，去上清并把沉淀重悬在50 μL TdT孵育缓冲液中，37℃孵育60 min，避光。每隔15 min用微量移液器轻轻重悬细胞。

10）加入1 mL 20 mM EDTA终止反应，用微量移液器轻柔混匀。
11）300×g离心10 min，去上清并把沉淀重悬在1mL配制于PBS中的0.1% Triton X-100溶液，其中含5 mg/mL BSA，重复一次，总共洗2次。
12）300 g离心10 min，去上清，细胞重悬于0.5 mL 用PBS新配制的5 μg/mL PI溶液中，其中包含250 μg无DNA酶的RNA酶A。

13）在黑暗中室温孵育细胞30 min。
14）用流式细胞仪分析细胞，在520±20 nm的荧光下观察绿色荧光；在＞620 nm下观察PI的红色荧光。PI能将凋亡和未凋亡的细胞都染成红色，只在凋亡的细胞核中才有Alexa Fluor 488-12-dUTP掺入而定位的绿色荧光。