PAGE电泳专用PCR Mix（2XPCR MagicMix for PAGE）

产品及特点 常规的 2×PCR Mix 由于含有各种添加剂（包括蛋白质），这些添加剂在扩增产物的 PAGE 电泳时不但会扭曲 DNA 条带，同时还能在 PAGE 银染时呈现很强的背景染色，干扰 DNA 银染条带的观察，为此本公司开发了此款 PAGE 电泳专用 PCR Mix，它内含 Taq DNA 聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR 增强剂等所有 PCR所需要的、但又不干扰 PAGE 电泳和银染的成分, 用户只需加入 PCR 模板和引物即可进行 PCR 反应, 它具有下列特点：

1. 不含会影响后续 PAGE 电泳和银染的成分。

2. 以 2×预配液形式提供，用户只需加入 PCR 模板和引物既可以进行 PCR 实验。

3. 快捷，操作步骤已经最大限度地简化，能减少污染，降低实验误差。

4. 本产品足够 50 次 40uL 体系的 PCR 反应。

5. 本产品仅供科研使用。

规格及成分 成 份 编 号 十孔盒包装

2×PCR MagicMix，PAGE 专用 190201 1 mL×5（绿盖）

使用手册 190201sc 1 份

运输及保存 低温运输，-20℃保存, 有效期一年。

自备试剂 PCR 模板、引物、超纯水、DNA-PAGE 电泳试剂。

使用方法 1. 以 40 uL 的标准 PCR 反应体系为例：在一干净的 PCR 管中，加入下列成分：

PCR MagicMix，PAGE 专用 20 uL

DNA 模板(自备)

哺乳动物基因组 DNA 0.5-1 ug

酵母基因组 DNA 5-500 ng

细菌基因组 DNA 0.5-50 ng

质粒 DNA 5-500 pg

PCR 回收片段 1-100 pg

PCR 引物(自备) 10 pmol each

补自备水到 40 uL

2. 放入 PCR 仪中进行 PCR, 结束后取 5-10 uL 扩增产物跟 PAGE 上样液混合后即可上样并进行 PAGE 电泳。

注意：

1．如果反应体系不是 40 uL，各成分需要等按比例增加或减少。

2．如果 DNA 模板中有 PCR 不明抑制物（植物、土壤和血液等 DNA 样品常含此类抑制物），可以在 PCR 体系中加入 1/10 的 PCR 抑制物清除剂（CAT#：60804，30uL 体系中加 3uL），可能会对 PCR 有帮助。

相关资料 PCR 反应的影响因素

变性温度与时间：模板变性温度是决定 PCR 反应中双链 DNA 解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链 DNA 模板，PCR 也就不会启动。变性温度低则变性不完全，DNA 双链会很快复性，因而减少产量。变性温度太高，又会影响酶的活性。一般情况

下可设为 94℃ 20~30 秒，高温时间应尽量缩短，以保持耐热 DNA 聚合酶的活力，

最高变性温度不宜超过 95℃。

退火温度与时间：退火温度决定 PCR 特异性与产量。温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA 扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。合适的退火温度一般在 45~68℃之间。设置特定反应的最适退火温度，可根据引物的（G+C）%含量进行推测，一般实验中退火温度比扩增引

物的熔解温度 Tm 低 5℃，退火时间一般为 30~60 秒，足以使引物与模板之间完全结合，长时间退火没有必要。

延伸温度与时间：PCR 反应的延伸温度一般选择在 70~75℃之间，延伸时间根据所用聚合酶扩增速度和扩增片段大小设定，如同样扩增 2 Kb 片段，若使用 Taq 酶只需 1分钟，使用 Pfu 酶则应设定 2 分钟以上。延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现，时间太短则可能得不到扩增产物或得到一些短的非特异性片段。循环次数：可根据模板 DNA 的量、扩增片段的大小和扩增产物的下步应用等因素，设定 20-40 个循环。循环次数太少，扩增量不足，如果循环次数太多，错配几率会增加，非特异性背景严重。所以，在保证产物得率的前提下，应尽量减少循环次数。

酶量：50 μL 反应体系可用 0.5-5 U 酶，酶量的选择与模板 DNA 的量，扩增片段大小等有关，酶量过多易发生非特异性反应，而且可能增加突变的机率，尤其在进行高保真扩增时，应尽量减少酶量，但酶量过少时反应性能下降。

模板：模板可以是单链 DNA，也可以是双链 DNA，质粒 DNA 的扩增效率略低于线状DNA。模板加量一般不需太多，不超过 1 μg 为宜，因为加量过多可能导致非特异性扩增增加，但是要考虑模板中靶序列的含量。例如，使用基因组为模板扩增单拷贝或低拷贝靶序列，就需要适当加大模板用量。

引物：引物与模板配对的长度应至少为17个核苷酸，最高不宜超过30个核苷酸，最佳长度为20~24个核苷酸，如需插入酶切位点，应在酶切位点5’端多加几个碱基，有利于酶切。引物的（G+C）%含量组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中（G+C）%含量应尽量相似。引物内部应避免形成明显的次级结构，如发夹结构。两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端。如果可能，引物3’端最好富有GC，这样退火后有利于引物3’端的延伸。人工合成的引物最好经过色谱层析纯化或PAGE纯化，以除去未能合成至全长的短链等杂质。引物的终浓度一般为0.1-2 μM左右，浓度太高会导致非特异性扩增，太低则扩增产物太少。