Klenow片段（3′→5′exo-），5U/uL

产品及特点 Klenow 片段是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的蛋白水解产物。它保留了 DNA聚合酶活性，具有 3’→ 5’外切酶活性，但不具有 5´→3´ 外切核酸酶活性。可以在 DNA 模板和引物存在的条件下，选择性地催化底物 dNTP 沿 5’→ 3’方向合成与模板互补的 DNA。本产品是重组表达得到，它具体有下列用途：

1. 双链 DNA5’突出末端的平滑化。

2. 用随机引物制备探针。

3. 随机引物标记法。

4. 寡核苷酸定向诱变（Oligonucleotide directed mutagenesis）中双链 DNA的合成。

5. 双脱氧法 DNA 序列测定（Sanger 法）。 规格及成分 成 份 编号 200U 塑料袋包装Klenow 片段（5U/uL） 131015A 20 uL

10×Klenow Fragment Buffer 131015B 1 mL

使用手册 1 份

活性定义： 以合成的 Poly d(A-T) DNA 为模板/引物，在 37℃、pH7.4 的条件下，30 分钟内使 10 nmol 的全核苷酸掺入酸不溶性沉淀物所需要的酶量定义为 1 个活性单位(unit)。

活性定义反应液：67mM 磷酸钾、pH7.4、6.7 mM MgCl2、0.1mM DTT、20uMDNA 模板、33 uM dATP，33uM【3H】dTTP

纯度：

1. 10 units 的本产品和 1 μg 的超螺旋 pBR322 DNA(Form I)在 37℃下反应 1小时，DNA 的电泳谱带不发生变化。

2. SDS-PAGE：＞95%。酶储存 buffer：50 mM 磷酸钾，pH 6.5，1 mM DTT，50%甘油10×Klenow Fragment Buffer： 100 mM Tris-HCl，pH7.5、70 mM MgCl2、1 mM DTT。注意：本 buffer 可用于标记或末端平化等常规实验，与活性定义所用的 buffer 组成不同。 运输及保存 低温运输，-20℃保存，有效期一年。 自备试剂 模板 DNA；引物

使用方法 使用举例：随机引物的同位素标记反应

1. 在微量离心管中配制下列反应液

成 份 用量

模板 DNA 25 ng

随机引物(6-9 mer)( 1 nmol/μl) 2 uL

补超纯水到 14 uL

2. 95℃保温 3 分钟。然后冰中急冷 5 分钟。

3. 加入 2.5 μl 10×Klenow Fragment Buffer。

4. 加入 2.5 μl dNTP (0.2 mM dATP,dGTP,dTTP)。

5. 加入 5 μl 111 TBq/mmol [α-

32P].dCTP (3000 Ci/mmol)(1.85 MBq, 50

μCi)

6. 加入 1 μl 本产品，反应液共 25 μl。

7. 37℃反应 3 小时。

65℃加热 5 分钟。反应液可直接作为探针使用。如有必要，可以通过用柱式探针纯化试剂盒除去未反应的标记的 dCTP。 注意事项 1． 本酶有高度稳定性，稀释时不失活，但剧烈搅拌会失活。

2． 由于不含有 5′→ 3′的外切核酸酶活性，因此没有切口平移活性。

3． 可用于双链 DNA 末端以及缺口（Gap）的修复。

4． 与 T4 DNA Polymerase 相比，对模板高级结构的抵抗性能较好。

5． 由于对 DNA 的亲和性较强，过量使用易发生凝集作用（Aggregation）从而抑制反应进行。

6． 若用于 5′突出末端的修饰时，补平后有时会多加一个碱基。

7． 与 DNA Polymerase I 相同，ddNTPs 的掺入不受底物抑制。