Hieff® Fast T4 DNA Ligase (400 U/µL)

产品信息

产品描述

Hieff^® Fast T4 DNA Ligase是一款可用于NGS建库过程中DNA片段和接头连接的单酶产品，该产品已经过高通量测序验证，质量优异。本酶具有高效的连接能力，非常适合复杂结构核酸片段的连接，比如华大平台的Ω接头。对于无需进行体系调整的客户，推荐选购Hieff NGS® Ultima DNA Ligation Module (Cat#12604)，其核心组分即为本品。

产品组分

运输和保存方法

冰袋运输。-20℃保存，有效期2年。

单位定义

在20 μL的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind Ⅲ分解物在16℃下反应30 min时，催化50%以上的DNA片段发生连接所需要的酶量定义为1个活性单位(U)。

质量控制

核酸外切酶残留检测：2000 U的本品和0.6 μg λ-Hind Ⅲ在74℃下反应1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。

核酸内切酶残留检测：2000 U的本品和0.6 μg Supercoiled pBR322 DNA在74℃下反应1小时，DNA电泳谱带不发生变化。

注意事项

1）Buffer在融解时，如果出现少量沉淀属正常现象，请颠倒混匀后使用。

2）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

1. 目前主流的合并法DNA建库试剂盒，其末端修复和加A处理后一般不纯化，直接进行接头连接。本试剂盒可与主流的商业化末端修复加A体系兼容，进行接头连接。反应体系请参考如下配制，涡旋瞬离后置于20℃，反应15 min即可。

表1  Adapter Ligation体系

【注】：*试剂盒内未提供50% PEG 6000，需自行准备。

**接头用量参考表2。

***Hieff® Fast T4 DNA Ligase用量可根据需要添加1-5 μL。

2. Adapter的质量和使用浓度直接影响连接效率及文库产量。Adapter用量过高可能会产生较多Adapter Dimer；用量较低可能会影响连接效率及文库产量。表2列举了使用本试剂盒，不同Input DNA量推荐的Adapter使用量。

表2  500 pg-1 μg Input DNA推荐的Adapter使用浓度

【注】：Input DNA摩尔数（pmol）≈ Input DNA质量(ng)/ [0.66 × Input DNA平均长度（bp）]。

【接头添加计算举例】：当Input DNA为100 ng，Input DNA长度为300 bp时，接头应该添加多少？

第一步，计算Input DNA摩尔数。公式：Input DNA摩尔数（pmol）≈ Input DNA质量(ng)/ [0.66 × Input DNA平均长度（bp）]；

Input DNA摩尔数（pmol）=100 ÷（0.66×300）=0.5 pmol；

第二步，计算接头添加摩尔数。根据表2查询接头添加比例；

根据表2，查得Input DNA 100ng时接头添加比例100:1，则接头添加摩尔数=100×0.5 pmol=50 pmol；

第三步，计算接头添加体积。接头浓度=15 μmol/L（如使用其他接头，浓度需要依据其他接头浓度参数）；

接头添加体积=接头添加摩尔数（50 pmol）÷接头浓度（15 μmol/L）=3.34 μL（注：15 μmol/L=15 pmol/μL）

综上，接头可添加3.4 μL。（注：接头最大加入体积不超过5 μL）