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Animal Blood Direct PCR Kit (With Dye) 全血直接PCR试剂盒

Product Introduction

Animal Blood Direct PCR Kit (With Dye) 全血直接PCR试剂盒

产品信息

产品名称	产品编号	规格	价格（元）
Animal Blood Direct PCR Kit (With Dye) 全血直接PCR试剂盒	YB044P	50 T	323.00
Animal Blood Direct PCR Kit (With Dye) 全血直接PCR试剂盒	YB044P	200 T	983.00

产品描述

全血直接PCR试剂盒是一款可以直接对全血样本进行PCR扩增的试剂盒，无需DNA提取或样品处理，大大降低了污染风险，缩短了检测时间。

试剂盒中包含配方优化的2× Blood Master Mix，具有很强抑制物耐受性，人血的模板最大加入量可达45%，鼠血的可达20%，可以灵敏的扩增血液样本中基因组和外源目的DNA片段。2× Blood Master Mix包含了用于PCR扩增除模板和引物外的所有组分，扩增产物末端加A，适用于Hieff Clone®快速克隆试剂盒（货号：10907ES60/10908ES60）。

该试剂盒可用于直接扩增的血样类型包括：新鲜血液、4℃贮存血液、冷冻血液以及储存在Whatman 903®和FTA®商用卡上的干血渍，且兼容所有常规抗凝剂（EDTA、柠檬酸盐、肝素等）。适用样本来源包括人血、鼠血、鸡血、鸟血、牛血、狗血等。

产品组分

编号	组分	产品编号/规格
		YB044P（50T）	YB044P（200T）
10186-A	2× Blood Master Mixa	500 µL	1 mL× 2

a）2× Blood Master Mix：包含Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl2、PCR反应增强剂、优化剂以及稳定剂等，产品已混合溴酚蓝染料（不含SDS），PCR产物可以直接进行电泳。

运输和保存方法

冰袋运输。-20℃保存。避免反复冻融。

操作方法

1. PCR反应体系配制

组分	体积（μL）	体积（μL）	终浓度
2× Blood Master Mix	10	25	1×
Forward Primer (10 μM)	0.5	1	0.2 μM
Reverse Primer (10 μM)	0.5	1	0.2 μM
抗凝全血	X	X	-
ddH2O	To 20	To 50	-

【注】：使用前务必充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。
a）模板使用量：进行基因组上的目的片段检测，建议使用少量的血液量作为模板；检测血液样本中某种病毒或细菌等的目的片段，建议扩大PCR体系并使用较大量的血液模板。血液模板最多占PCR体系的45%（人血）、20%（鼠血）。若模板使用含有血液的采集卡，可截取直径1-4 mm的血点，直接加入20-50 μL PCR反应体系进行扩增。

b）引物浓度：通常引物终浓度为0.2 μM，也可以根据情况在0.1-0.5 μM之间进行调整。

c）反应体系：推荐使用20 μL或 50 μL，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。

d）体系配制：配制好PCR反应体系，置于涡旋仪上涡旋混匀，瞬时离心将反应液集于管底。

2. PCR反应条件设置

循环步骤	温度	时间	循环数
预变性	95℃	5 min	1
变性	95℃	10 sec	30-40
退火	50℃～65℃	20 sec
延伸	72℃	30 sec/kb
终延伸	72℃	5 min	1

【注】： a）预变性：95℃，5 min可以让白细胞裂解，释放可用于PCR扩增的基因组DNA。请勿缩短时间或降低温度。

b）退火温度：退火温度设置为引物Tm值即可。然而，使用高的退火温度可以有效减少非特异性扩增，并提高全血模板的扩增效率。因此，如扩增产物特异性较差，可以建立一个温度梯度反应去寻找引物模板最适退火温度。

c）延伸时间：按30 sec/kb设定，如不足30 sec，设置30 sec即可。

d）扩增循环数：35个循环已可以扩增足量产物。太多的循环将会导致非特异性扩增增加。

3. 扩增产物分析

PCR完成后，建议将反应液于1000× g (大约4000 rpm) 离心1～3 min以沉淀血细胞碎片，之后取上清进行下游分析。该步骤可有效去除多种血液组分。当使用高浓度血液模板时此步尤为重要，因为经过PCR循环，反应管中会存在大量的血细胞碎片。这些碎片会干扰下游的检测，如琼脂糖电泳检测。注意：由于血液本身的原因，PCR 结束后在 PCR 管的底部会出现透明凝胶状物质，此为正常现象。

4. 对照反应

在PCR结果分析时，不管是阳性结果或阴性结果，如果没有对照反应，都不能确定结果是否可靠。为了便于后续实验结果的分析，建议在进行PCR时，设置阳性和阴性PCR对照反应以便于排除假阳性或假阴性的干扰。

4.1 阳性对照反应体系

组分	体积（μL）	体积（μL）	终浓度
2× Blood Master Mix	10	25	1×
Forward Primer (10 μM)	0.5	1	0.2 μM
Reverse Primer (10 μM)	0.5	1	0.2 μM
模板DNA	X	X	100-200 ng
ddH2O	To 20	To 50	-

【注】：a）模板DNA：选用样本纯化的DNA。

b）引物的选择：建议选择该样本较易扩增的基因的引物，如 β-actin 基因或 GAPDH 等。

4.2 阴性对照

PCR反应体系被污染会导致PCR结果出现假阳性，需要设置阴性对照来排除。将使用的移液器枪头浸泡在2× Blood Master Mix中，添加引物，ddH2O进行PCR扩增；另取ddH2O作为模板，用目的基因引物进行PCR扩增，以排除PCR体系是否被污染和实验是否有其他污染源。

注意事项

1. 尽量使用新鲜抗凝血。若冻存血，应避免反复冻融。

2. 解冻后2× Blood Master Mix可能出现浑浊，冰上放置1-2 min，待溶液澄清后，上下颠倒混匀，不影响试剂性能。
3. 建议扩增片段长度1 kb以内，以便扩增效率最佳。

4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

常见问题与解决方法

常见问题	可能原因	解决方法
阳性对照、待测样本均无条带。	PCR反应体系或反应条件不合适。	使用梯度PCR摸索PCR最佳反应条件。
	PCR试剂保存不当失去活性。	2× PCR Mix应保存于-20℃，使用时避免反复冻融。若使用频繁，可在4℃短时间存放。
	引物设计问题。	尝试重新设计引物进行检查。
阳性对照有目的条带，待测样本无条带或条带弱。	血液样本保存不当，基因组DNA降解。	抗凝全血可在4℃保存2-8天，需长时间保存可将样本置于在-20℃或-70℃冻存，并避免反复冻融。
	模板加入量不适合。	可在PCR体系10%-30%范围内优化血液加入量；若是扩增血液样本中的病毒或细菌DNA片段，可将模板量增加至30%-40%。
	PCR循环数不足。	适当增加PCR的循环数，推荐在35-40循环为佳。因为模板复杂，一般PCR反应要比用纯化的 DNA模板多5-10个循环为佳。
非特异性扩增	PCR退火温度太低，循环数、引物浓度或模板浓度太高。	增加PCR退火温度，降低PCR循环数、引物浓度或模板浓度。
	PCR引物错配。	重新设计PCR引物。
	配制PCR反应体系时温度太高或配制完成后放置时间太久。	PCR反应体系的配制在低温下进行，配制完成后尽快进行PCR扩增反应。
阴性对照出现目的条带	操作工具或试剂污染。	实验所有试剂或器材均应高压灭菌。操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。