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Mouse Tissue Direct PCR Kit

Product Introduction

Mouse Tissue Direct PCR Kit

产品信息

产品名称	产品编号	规格	价格（元）
Mouse Tissue Direct PCR Kit 小鼠组织直接PCR试剂盒	YB047P	50 T	293.00
Mouse Tissue Direct PCR Kit 小鼠组织直接PCR试剂盒	YB047P	200 T	883.00

产品描述

小鼠组织直接PCR试剂盒是一款可快速对小鼠鼠尾、鼠耳、肌肉等组织样本进行PCR扩增的试剂盒。本试剂盒采用独特的裂解缓冲液体系，可以快速的裂解样品并释放出基因组DNA，不需要除去蛋白、RNA等，即可将释放出的基因组DNA作为模板直接用于PCR反应。此外，样品使用量少，低至5 mg小鼠组织或2-5 mm鼠尾即可进行实验。

本试剂盒中提供的2× Mouse Master Mix具有很强的扩增兼容性，能直接以待测样品裂解液为模板，进行高效特异性扩增。该试剂为2倍浓缩PCR反应混合液，包含了用于PCR扩增除模板和引物外的所有组分，大大简化操作过程，降低污染几率。

该试剂盒可用于转基因型鉴定、动物基因分型等。

产品组分

类别	编号	组分	产品编号/规格		储存
类别	编号	组分	YB047P（50 T）	YB047P（200 T）	储存
Part I	10181-A	Buffer MP	5 mL	20 mL	室温或4℃
	10181-B	Protease Plus	220 μL	880 μL	4℃
	10181-C	6× DNA Loading Buffer^a	1.5 mL	1.5 mL	4℃或-20℃
Part II	10181-D	2× Mouse Master Mix^b	500 μL	1 mL×2	-20℃

a）6× DNA Loading buffer：不含SDS。

b）2× Mouse Master Mix：包含Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl₂、反应缓冲液、PCR反应增强剂、优化剂以及稳定剂等。

运输方法

冰袋运输。

保存方法

1. 试剂10181-A【Buffer MP】，在常温干燥条件下，可保存12个月，如需保存更长时间可置于4℃。低温保存，易出现沉淀，可平衡至室温或37℃水浴10 min，待沉淀溶解后，混匀使用。

2. 试剂10181-B【Protease Plus】，具有独特配方，为保证其更好的活性和稳定性，建议4℃保存，切勿置于-20℃。

3. 试剂10181-C【6×DNA Loading Buffer】，可置于4℃或-20℃长期保存。

4. 试剂10181-D【2× Mouse Master Mix】，-20℃保存，避免反复冻融。

操作方法

样品基因组DNA释放

1. 在离心管中加入100 μL Buffer MP，4 μL Protease Plus，轻轻涡旋混匀。

【注】：Buffer MP与Protease Plus混合后尽快使用，不宜长期保存。

2. 取5-10 mg动物组织或2-5 mm鼠尾，置于上述离心管中，轻轻涡旋混匀。

【注】：组织应尽量剪碎，以便酶解反应更顺利进行。

3. 65℃孵育10-30 min，然后95℃处理5 min。

【注】：65℃孵育，一般10 min即可满足多数PCR需求。若需要的DNA量较大或样品较难酶解，可将时间延长至30 min。组织块不需完全酶解，残余的部分在后续离心步骤中可被除去。

4. 12000 rpm离心5 min。

5. 将上清转移至新的离心管，4℃或-20℃保存或直接用于PCR扩增。

PCR反应鉴定——PCR反应体系

组分	体积（μL）	体积（μL）	终浓度
ddH₂O	To 20	To 50	-
2× Mouse Master Mix	10	25	1×
Forward Primer (10 μM)	0.5	1	0.2-0.25 μM
Reverse Primer (10 μM)	0.5	1	0.2-0.25 μM
裂解产物（DNA模板）	X	X	-

【注】：各组分使用前应充分混匀。

a）模板使用量：建议1-10%总体系，可设置梯度摸索最佳上样量。模版量过多时，抑制物会显著影响扩增效果。

b）引物终浓度：0.2-0.25 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可在0.1-0.5 μM范围内调整引物浓度。

c）反应体系：推荐使用20 μL或50 μL，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。

d）体系配制：配制好PCR反应体系，置于涡旋仪上涡旋混匀，瞬时离心将反应液集于管底。

PCR反应鉴定——PCR反应条件

循环步骤	温度	时间	循环数
预变性	94℃	3 min	1
变性	94℃	10 sec	30-40
退火	50-65℃	20 sec
延伸	72℃	30 sec/kb
终延伸	72℃	5 min	1

【注】：

a）退火温度：请参考引物的理论Tm值，建议退火温度可设置高于引物理论值 2℃。

b）延伸时间：按30 sec/kb设定，如不足30 sec，设置30 sec即可。

c）扩增循环数：35个循环已可以扩增足量产物。太多的循环将会导致非特异性扩增增加。

对照反应

在PCR结果分析时，不管是阳性结果或阴性结果，如果没有对照反应，都不能确定结果是否可靠。为了便于后续实验结果的分析，建议在进行PCR时，设置阳性和阴性PCR对照反应以便于排除假阳性或假阴性的干扰。

注意事项

1. 为了避免样本间交叉污染，每次取样后都需要将取样器材的刃口或与样本直接接触的部位浸入2%次氯酸钠溶液中，反复洗刷数次进行清洗，然后用干净的纸巾擦干残余液体后再进行使用。为了试验方便，也可准备多个取样器材，在使用完后进行统一清洗，确保每一单独样本均使用的是无污染的取样器材。

2. 建议使用新鲜采取的动物组织，若为长期冷冻组织，应尽量避免反复冻融，否则会导致模板的降解，影响PCR效率。

3. 试剂Buffer MP若低温保存，易产生沉淀。在使用前务必将其在室温中放置一段时间，也可在37℃水浴中预热10 min，以溶解沉淀，混匀后再使用

4. 建议扩增片段长度1 kb以内，以便扩增效率最佳。

5. 电泳检测时，切勿使用含有SDS的Loading Buffer。否则，电泳时会在泳道中出现一大团拖尾亮带，影响实验结果。

6. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

常见问题与解决方法

常见问题	可能原因	解决方法
阳性对照、待测样本均无条带。	PCR反应体系或反应条件不合适。	使用梯度PCR摸索PCR最佳反应条件。
	PCR试剂保存不当失去活性。	2× PCR Mix应保存于-20℃，使用时避免反复冻融。若使用频繁，可在4℃短时间存放。
	引物设计问题。	尝试重新设计引物进行检查。
阳性对照有目的条带，待测样本无条带或条带弱。	不当储存或长期储存引起试剂活性丧失。	使用新鲜的试剂。
	加入组织裂解液过量。	增大反应体系，或减少裂解液的用量。
	样本裂解混合液保存不当或保存时间过久，DNA基因组已经降解。	裂解混合液液可在4℃保存2-3天，尽量使用新制备的裂解液混合液进行PCR。
	模板加入量不适合。	在反应体系10-20%范围内优化模板加入量。反应效性能较差时，可以降模板浓度调节到低于10%的范围。
	PCR循环数不足。	增加PCR的循环数，推荐在35-40循环为佳。因为模板复杂，PCR反应要比用纯化的DNA模板多5-10个循环为佳。
非特异性扩增	PCR退火温度太低，循环数、引物浓度或模板浓度太高。	增加PCR退火温度，降低PCR循环数、引物浓度或模板浓度。
	PCR引物错配。	重新设计PCR引物。
	配制PCR反应体系时温度太高或配制完成后放置时间太久。	PCR反应体系的配制在低温下进行，配制完成后尽快进行PCR扩增反应。
阴性对照出现目的条带	操作工具或试剂污染。	实验所有试剂或器材均应高压灭菌。操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
阴性对照出现目的条带	样本间交叉污染。	每个取样器只对一个样本使用；或取完一个样本后，将取样器刃口浸入2%的次氯酸钠溶液中，反复涮洗，然后用干净的纸巾擦干残液。